μ-Slide 8 Wellhigh（貨號(hào)：80806）8孔高壁進(jìn)行**熒光染色

**熒光(IF)是使用顯微鏡深入了解細(xì)胞結(jié)構(gòu)和過程的有效方法。此方法可評(píng)估特定蛋白質(zhì)的表達(dá)和位置，使得**熒光成為科學(xué)家解決許多細(xì)胞生物學(xué)問題不可或缺的工具。

下面我們將介紹一種在ibidi μ-Slide 8 Well high 八孔高壁載玻片中培養(yǎng)和**熒光染色的貼壁人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的一體化簡(jiǎn)單便捷的方法：

請(qǐng)注意：在開始細(xì)胞**熒光實(shí)驗(yàn)之前，需要檢查幾個(gè)重要參數(shù)，例如目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平、*佳細(xì)胞密度以及理想的培養(yǎng)細(xì)胞的耗材和基質(zhì)/涂層。還應(yīng)評(píng)估*佳抗體稀釋度。此外，陽(yáng)性和陰性對(duì)照是驗(yàn)證**熒光染色的必要條件。因此，我們強(qiáng)烈建議在實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行**的文獻(xiàn)研究。

1. 材料

1.1. 試劑和緩沖液：

? 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC、C-12203、Promocell）

? 膠原蛋白 IV（354233，Corning）

? 0.05M HCl (X942.1, Carl Roth)

? 細(xì)胞培養(yǎng)基：內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基（C-22210，Promocell）和內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基補(bǔ)充混合物（C-39215，Promocell）

? PBS（14190144，Gibco）

? Accutase（A1110501，Gibco）

**熒光染色：

?  PBS（14190144，Gibco）

? 福爾馬林，10%，即用型（HT5011，Sigma Aldrich）

? 單克隆抗 α-微管蛋白（T5168，Sigma Aldrich）

? 抗小鼠 IgG-Atto 594 (76085 Sigma Aldrich)

? 鬼筆環(huán)肽 488 偶聯(lián)物（ab176753，Abcam）

? 使用DAPI 的ibidi 抗熒光淬滅劑（50011，ibidi）

? Triton-X-100（A16046，Thermo Fisher Scientific）

? 穿透緩沖液（PBS 中0.5% Triton-X-100）

? 封閉緩沖液（PBS 中1% BSA + 0.2% Triton X 100）

? 抗體稀釋緩沖液（1% BSA + 0.05% Triton X 100 的PBS 溶液）

? 牛血清白蛋白 (BSA) (A1470-10G, Sigma Aldrich)

? ibidi浸油（50101，ibidi）

1.2. 設(shè)備：

80806八孔高壁

μ-載玻片架（80003）

? μ-Slide 8 Well high 8孔高壁腔室載玻片，ibiTreat（80806，ibidi）

? μ-載玻片架（80003，ibidi）

? 標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備（移液器、無(wú)菌工作臺(tái)、細(xì)胞培養(yǎng)箱、培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)基、血細(xì)胞計(jì)數(shù)器等）

? 帶有適當(dāng)濾光片組的倒置熒光顯微鏡

2. 方法

2.1. 細(xì)胞培養(yǎng)：

使用前μ-Slide 8孔高壁腔室載玻片前，請(qǐng)閱讀說(shuō)明書。在無(wú)菌條件下執(zhí)行所有步驟。實(shí)驗(yàn)開始前，在標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)瓶中制備 HUVEC(如T75，用0.05 M HCl包被6.7μg/ml IV膠原蛋白1 小時(shí))，細(xì)胞貼壁。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天細(xì)胞應(yīng)該是健康的并且處于*佳匯合狀態(tài)。

在整個(gè)過程中快速工作很重要，這樣孔中才不會(huì)干涸。

如果未另行說(shuō)明，則所有給定的體積都為每孔的體積，所有的孵育步驟都是在室溫下進(jìn)行的。

? 用Accutase處理培養(yǎng)的HUVEC 1-2分鐘以進(jìn)行分離。

? 收集細(xì)胞懸液，離心，用少量培養(yǎng)基稀釋后進(jìn)行計(jì)數(shù)；量取決于所需的細(xì)胞濃度。

? 計(jì)數(shù)細(xì)胞，在內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基和內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基補(bǔ)充混合物中，并調(diào)整到*終濃度為 2 x 105cells/ml 。

? 打開 ibidi μ-Slide 8 Well高壁的包裝并將其放在μ- Slide Rack或適當(dāng)?shù)谋砻嫔稀?

? 在每個(gè)孔中加入250μl的HUVEC懸浮液。

? 蓋上隨附的蓋子。

? 將載玻片與支架一起放入培養(yǎng)箱（37°C，5% CO2）中，讓細(xì)胞附著至少3小時(shí)或過夜。

? 對(duì)于延長(zhǎng)細(xì)胞培養(yǎng)，我們建議每隔**更換一次培養(yǎng)基。

2.2. 固定、透化和封閉：

? 為您的實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備足夠的穿透緩沖液和封閉緩沖液。

? 使用細(xì)胞培養(yǎng)吸液裝置從孔中吸出細(xì)胞培養(yǎng)基。

? 用PBS清洗細(xì)胞：將200 μl PBS緩慢加入每個(gè)孔中并吸出。

? 用200μl福爾馬林 (10%) 固定細(xì)胞10分鐘。

? 去除福爾馬林并用200μl PBS洗滌細(xì)胞3次。

? 將細(xì)胞在200μl穿透緩沖液中孵育10分鐘。

? 去除穿透緩沖液并用200μL PBS清洗細(xì)胞。

? 用200μl封閉緩沖液封閉30分鐘。

2.3.染色和封片：

? 在封閉步驟中，準(zhǔn)備足夠的抗體稀釋緩沖液來(lái)稀釋一抗和二抗。

? 在抗體稀釋緩沖液中稀釋一抗（α-微管蛋白：1:200稀釋）。

? 將細(xì)胞在150μl一抗溶液中孵育 2 小時(shí)（請(qǐng)注意，許多抗體需要在4°C下過夜孵育）。

? 用200μl Blocking Buffer清洗兩次。

? 在相同的抗體稀釋緩沖液中稀釋二抗和鬼筆環(huán)肽（anti-mouse-IgGAtto 594：1:200 稀釋度；鬼筆環(huán)肽488偶聯(lián)物1:1000 稀釋度）。

? 在黑暗中將細(xì)胞在150 μl的二抗溶液中孵育 2 小時(shí)。從此時(shí)起，樣品應(yīng)盡可能保存在黑暗中

? 用200 μl Blocking Buffer清洗兩次

? 清空所有孔。

? 每孔加入一滴含有DAPI的ibidi封固劑。

? 儲(chǔ)存在4°C的黑暗中，直到成像。*好立即進(jìn)行成像，因?yàn)檩^長(zhǎng)的存儲(chǔ)期可能會(huì)降低圖像質(zhì)量。

2.4.成像：

? 使用適當(dāng)?shù)臑V光片組在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞，必要時(shí)使用ibidi 浸油。

? 可選，覆蓋圖像以創(chuàng)建合并圖像。

3. 結(jié)果

HUVEC 在μ-Slide 8孔高壁腔室載玻片中**染色 ，寬視場(chǎng)熒光顯微鏡。F-肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架被鬼筆環(huán)肽（紅色）染色。α-微管蛋白抗體用于染色微管（綠色）。用 DAPI（藍(lán)色）可視化細(xì)胞核。該圖像是在尼康顯微鏡上使用具有油浸的 60 倍物鏡拍攝的。

如果您的**熒光(IF)染色未達(dá)到預(yù)期效果，您可以在這里（**熒光染色故障排除指南）里找到故障排除提示！